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抑制性差减杂交技术在基因克隆中的运用现状论文
摘要：抑制性差减杂交技术是一种差异性基因克隆的新技术，它对研究细胞生殖、发育、分化、衰老及死亡等生命过程中有关基因的差异表达及相关基因的分子克隆提供了有力的技术工具。简要概述了抑制性差减杂交技术的基本原理、优越性、缺陷及其在相关基因克隆方面的应用研究进展。
关键词：基因克隆；抑制性差减杂交；应用
生物体的生命过程伴有异常复杂的生物生化变化，是生物体内相关基因的有序表达和调控的结果。对相关差异性表达基因进行深入研究，能够更加深入地了解生物体的生命活动规律。目前，分离差异性表达基因的主要技术为杂交技术（subtractive hybridization）和差示筛选技术（differential scre-ening），但这些技术存在重复性差、敏感度低等缺点。随着现代 PCR 技术的发展，一系列基于 PCR 技术的分离差异性基因表达的新技术被开发出来。SSH技术就是一种利用抑制性 PCR 和以差减杂交技术为基础的一种简单、快速地分离差异性表达基因的方法，该技术在研究基因克隆、基因表达及基因功能等方面有明显的优势[1].笔者对使用 SSH 技术进行研究的应用现状及其未来前景进行了简单介绍，旨在使 SSH 技术的应用得到更加深入的认识。
1SSH技术的过程及其优缺点
1.1SSH技术的过程
SSH 研究应用的材料可以是基因组 DNA,也可以是 c DNA,用于分离克隆 2 个样品中特异基因或者是差异性表达的基因。基本过程是：抽提 2 种不同生物体的 DNA 或 c DNA;将经限制性内切酶消化后的 Tester DNA 分为 2 个部分，分别与 2 种接头连接；再将这 2 个部分序列于过量酶切的 Driver DNA杂交，当这 2 个部分 DNA 被最终混合杂交后，就允许了同源性的单链 DNA 分子杂交；通过 PCR 扩增、克隆即可分析所差减的序列。
1.2SSH技术具有的优点[2]
高效高速。在一次 SSH 杂交试验过程中，就可以同时分离出上百个差异性表达的基因。灵敏度高。在退火时，高丰度的单链 DNA 同源杂交的速度快于低丰度的单链 DNA,导致原来在丰度上有差别的单链 DNA 在相对含量上能够达到一致，从而对于低丰度的基因也可以通过基因克隆表达出来。假阳性率低。经过 2 次杂交和 2 次 PCR 扩增选择性地扩增差异表达目的 DNA ，提高了特异基因的筛出率，使得假阳性率大大降低。简单易行，对仪器设备要求不高。背景低、重复性高。
1.3SSH技术存在的不足[2]
基因组中酶切位点较少的不适用 SSH 技术；分离到的差异表达基因片段，还需要扩增全长；起始材料相对要求较多，不适于来源困难的样品；对试验材料的要求较高，试验材料间差异性要求较低。
2SSH技术的应用
2.1SSH技术在医学上的应用
孙守娟等[3]采用 SSH 技术 ,构建了舌鳞癌 Tca8113 细胞系中高、低醛脱氢酶活性细胞差异表达基因 c DNA 文库，用 Trizol 分别提取 2 个细胞的总RNA;用 SSH 技术对 2 组 RNA 进行差异基因筛选和扩增，克隆片段均匀分布在 250~750 bp,无假阳性克隆。测序结果经同源性比对分析可知 ,与肿瘤有关的基因有SLC25,A13 NPC1,KLHL2,BARD1,WAPL,Notch2,EEF2K.车红花等[4]通过 SSH 技术，克隆了受病毒攻击的宿主细胞中被中药有效成分调控的基因，结果显示，核糖体蛋白 L27a 在中药组中高表达，病毒组中表达减弱或被抑制；益气活血中药复方能够影响受 CVB3 攻击的宿主细胞核糖体蛋白 L27a 的表达，有效保护心肌、阻断病程进度，实现治疗病毒性心肌炎的目的。
李守明等[5]采用抑制性差减杂交技术，鉴定母鼠铅暴露后代海马差异表达基因，构建了一个近200 个克隆的差减基因文库，得到 93 个有效克隆，从中克隆和鉴定了母鼠铅暴露致使学习和记忆能力显着下降的幼鼠中海马差异表达的基因，共 43种不同的基因以及 4 种未知功能基因。这些基因包括一些看家基因和一些与细胞蛋白折叠、信号传导、应激响应及 DNA 甲基化相关功能的基因。
2.2SSH技术在植物学上的应用
刘蕾等[6]应用 SSH 筛选植物青枯菌致病相关基因，研究该菌株致病力分化机理，以 Po82 为待测菌株，构建了抑制性差减杂交文库，结果表明，具有较高的接头连接以及文库构建效率，插入片段平均长度为 300 bp,文库构建质量较好。对文库中随机挑取阳性克隆进行测序，共筛选出 44 个 Po82 菌株差异基因。生物信息学分析结果表明，所得差异基因主要涉及新陈代谢、膜结构、转坐酶、毒力、分泌蛋白、转录因子以及未知功能等。闵卓等[7]以赤霞珠葡萄新梢上冬芽和夏芽为材料（夏芽作为驱动方，冬芽作为试验方），采用 SSH 技术构建冬芽和夏芽的c DNA 文库，筛选冬芽和夏芽差异表达的基因片段，结果发现了一些在冬芽中表达频率较高的基因，如编码 MADS FLC-like 蛋白、钙依赖蛋白激酶、NADP依赖型的苹果酸酶、细胞壁水解酶、细胞壁松弛蛋白、外被体蛋白β亚基、热激蛋白、衰老相关蛋白、细胞色素 P450、细胞壁关联蛋白等基因；同时还认为，线粒体蛋白基因、开花相关基因、未知蛋白基因、ATP 合成酶β亚基基因、MADs FLC-like 蛋白基因等与葡萄芽生理休眠具有相关性。叶晓明等[8]以温敏雄性不育系 K121S 在可育温度 10℃下和不育温度 26℃下三核期花蕾为材料，以可育温度下的c DNA 为驱动子，采用 SSH 技术构建了不育温度下SSH 文库，随机挑选 97 个阳性菌落测序，得到 20个表达序列标签（EST），包括与 ATP 合成酶β亚基、Rubp 羧化酶小亚基同源的 EST 等，为进一步获得育性转换相关基因和揭示 K121S 的育性转换分子机制奠定了基础。
2.3SSH技术在微生物学上的应用
李淼等[9]采用 SSH 技术寻找副猪嗜血杆菌的毒力基因，以无毒力菌株 H465 和有毒力菌株 SW124为材料，构建了 SSH 文库，使用 Southern 杂交和PCR 鉴定对差异基因片段进行筛选结果显示，从构建的文库中得到 7 个特异性差异基因片段，其中，2个差异基因片段与功能未知蛋白基因有关，5 个片段分别与膜多糖磷酸酶 / 糖基转移酶、磷酸核糖甲酰甘氨脒合酶、荚核糖体蛋白丙氨酸、转移酶噬菌体重组蛋白和 ABC 型硝酸盐，碳酸氢盐 / 磺酸盐转运系统周质蛋白等编码的基因有同源性。
祝昊丹[10]采用 SSH 技术将无毒株 SH040917SS9与强毒株 SH040917 进行杂交，共获得 61 个毒力特异的基因片段，结果表明，这些片段与 30 种不同的蛋白编码基因具有同源性，包括类枯草杆菌丝氨酸蛋白酶、DNA 核酸酶、溶血素相关蛋白酶、苏氨酸磷酸化蛋白酶等。
戴建君[11]采用 SSH 技术对禽致病性大肠杆菌菌株和人尿源性大肠杆菌差异性表达基因序列进行了相关研究，结果发现了 28 个新毒力基因片段，并对这些基因片段流行病学进行了调查研究，发现大部分新的毒力基因与流行病学有较大的相关性。
2.4SSH技术在动物学上的应用曲
宪成等[12]应用 SSH 技术构建了黄鳝 IV 期卵巢和间期性腺的差减 c DNA 文库，正向差减杂交以间期性腺为试验方，IV 期卵巢为驱动方；反向差减杂交以 IV 期卵巢为试验方，间期性腺为驱动方，将获得的差减 c DNA连接质粒载体，然后转化大肠杆菌 DH5α，最后获得的正、反向差减文库分别含461,678 个重组子。经 PCR 扩增鉴定，插入片段范围为 200~2 000 bp.随机选取正、反文库共 100 个阳性克隆测序分析，得到 90 个有效基因片段，与Gen Bank 进行 BLASTx 和 BLASTn 同源比对，进一步从文库中选取 2 个基因用于半定量 RT-PCR,对文库质量进行验证，结果表明，所建文库能够达到富集 IV 期性腺差异表达基因的目的。黄鳝性腺差减文库的构建，为进一步分离、鉴定黄鳝性腺发育和性逆转的相关基因奠定了基础。
李超等[13]利用 SSH 技术，以链球菌疫苗免疫前后罗非鱼白细胞 c DNA 为材料，构建了罗非鱼免疫前后正、负 2 个 c DNA 差减文库，并采用地高辛（DIG）标记差减文库 c DNA 作为探针，进行差异表达片段的筛选鉴定，结果显示，2 个文库重组率均在90%以上，插入片段在 300~900 bp,接头连接效率超过 50%,差减效率非常高，阳性率均超过 70%.杂交筛选后，对正、负文库各挑选 30 个阳性克隆进行测序组装聚类，正、负文库分别获得 16,18 条 EST,所得序列经 Gen Bank 同源性分析，正、负文库分别有 10,11 条 EST 获得功能注释，且分别有 6,7 条unigene 没有同源性匹配，定为未知新基因。
刘晶等[14]采用 SSH 技术，研究营养素对皱纹盘鲍基因表达的影响，对构建的文库中 48 个克隆进行了测序，结果发现了 32 个已知功能基因和 16 个新基因。王嘉等[15]采用 SSH 技术研究皱纹盘鲍 Vc缺乏诱导的差异表达基因，共获得了 63 个基因片段，其中，已知功能基因有 34 个；在 c DNA 文库中获得 39个片段，其中，已知功能基因有 21 个，包括细胞代谢、生物调节等相关基因。
另外，梅冰[16]利用 SSH 技术对溶藻弧菌的毒力相关基因进行筛选和鉴定研究，构建溶藻弧菌毒力菌株 SSH 文库，结果显示，所构建的溶藻弧菌毒力菌株的 SSH 文库含有 8 个已知的常见毒力相关功能基因，该文库还含有 166 个未知新基因，占文库中总基因数的 68.44%,溶藻弧菌的毒力基因很可能存在于这些未知新基因中。说明构建的 SSH 文库中 166 个未知新基因很有可能包含有溶藻弧菌的关键毒力基因，为溶藻弧菌毒力基因的鉴定和今后开展溶藻弧菌基因工程疫苗的研制奠定了重要的基础。
3展望
在现代生命科学研究领域中，差异基因的筛选和鉴定已成为现代分子生物学研究的热点。SSH 技术操作简单、所需试验仪器廉价、试验过程简单、阳性率高，分离差异基因提供了一种强有力的工具。随着 SSH 技术的不断改进，在生物研究的各个领域，如微生物学、动物学、植物学、医学等领域得到了大力的推广。在未来的发展中，SSH 将与其他分子生物学技术相结合，各取所长，为研究差异基因的表达提供新的技术手段。
参考文献：
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[6]刘蕾，徐进，许景升，等。 应用抑制性差减杂交法筛选植物青枯菌致病相关基因[J]. 农业生物技术学报，2012,20（7）：745-755.
[7]闵卓，耿万刚，房玉林，等。 应用抑制消减杂交技术筛选葡萄冬芽和夏芽生理休眠相关基因 [J]. 中国农业科学，2014,47（5）：1029-1040.
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[9]李淼，李春玲，宋帅，等。 应用抑制性差减杂交筛选副猪嗜血杆菌 4 型菌株可能毒力基因[J]. 华北农学报，2012,27（1）：57-62.
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[11]戴建君。 禽致病性大肠杆菌 IMT5155 疑似毒力基因的鉴定及分析[D]. 南京：南京农业大学，2010.
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[16]梅冰。 溶藻弧菌的分离鉴定及其毒力菌株 SSH 文库的构建[D].海口：海南大学，2009.
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