总蛋白提取

时间：2023-05-01 06:32:48 资料我要投稿

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总蛋白提取

、一胞裂解物的制备：

细．1单去污裂剂缓冲液：1解%N-4P或0Titorn -X10 0裂解缓液冲系：体

N-P4 o0 Tritonr10-01% T

rs-iCH (lpH 8.0)50 mmlo/L Na

lC1 50mml/L oP

MF（苯甲基S酰氟）磺 01.momlL/(001gμ/l)m Pe

ptasitn胃蛋(酶白制抑剂) 1moμlL(/0.μ7g/m)

leLpuetipn（抑亮肽制 0.5mg）ml /

pAortiinn（蛋抑白酶）肽0.3moμ/L(l1μ/gl) m

（注：MPS F贮存液1：00mmo/Ll即714m./mg于异丙醇l；中

Aroptinni贮液：10mg/存ml于0溶.0m1o/LHElESPp(8.0)H; L

eueptinp 贮液存1：0m/gm溶l水于中；

ePptasitn 贮存 10液mgml于甲醇/中.液均于20-℃存保）操

作程序：* 离

收心1×10集个细胞7

加*4入预冷1℃N%-P0裂解410液0μl

*烈剧荡震细使胞充悬分浮匀混如为组织进行匀浆（） *

4放℃15置~0mi3n

* 4℃心离，1 0500rm,1p0in，取上清备用。m

二、蛋质浓白度测定

：.简单1：的用28n0测m光值吸标准，线曲2

精.的：用bio确r-d a剂试盒具，见体件附三

、丙聚酰烯胺凝电泳（SDS-胶APGE）

样和品层积中含胶rTsi-l(CHp6.)，上下槽8缓冲含液rTs-甘i酸(氨p8H3)，.离分中胶含rTi-sl(CH8.8)p的。统系所中组分有含都0.1有的％DSS，样品和积胶中的层离氯形子成动界面的移导先界边而甘酸氨分则子成组尾随边界在，移动界面两的界之间边是一导较电低电而位度较梯的区陡域它推，动品样的中肽多前移在分并离胶前积沿聚此处pH值较高，，利于甘氨有的酸子化离，所成的甘氨酸形离穿子堆过的集多并紧随氯肽离之子后，分离沿泳动胶从。移界动面中解后脱S，D多S复合肽成物一电位pH和值匀的均区泳带动过分离胶，并穿筛被分依而各的大小得到自离。按所需分离分蛋白的质分子小选择大适的丙合烯胺百分比浓度酰一般，，5地％的凝胶可于用6～020k0Da的SD变S蛋白质性分子的分，离01％于用6170kD～a15％，用1于2～54Dk。 a（

一）材、料：1

30．%（WV/）car凝y贮存胶液丙

酰胺烯 9g，2亚甲双丙烯胺酰 1g加ddH2O 溶 1至00lm,新华滤纸过滤，棕用色中瓶4保存，℃月后重新配制。数

2 1..5ol/m TLis-rHl pC 8H.8

risT abe s1.851 g

加dd2O 5H0lm,加浓酸盐pH 至.8(84约ml,让溶液)却至室温冷再用d，Hd2定O容至100ml.

.3 1.0ml/o TLrsi-Cl pHH6 8.

Tris abse 2.11 g加

ddH2O 05lm,加浓盐酸p至H6. 8约8ml),让溶(液冷至室却，温用再dH2Od容定10至0lm .

4．.05mo/L lrTs-HCil ,Hp6.8

Tris b sa e.60g

加 6ml dd02OH加,盐浓酸p至 6H.,定容至801ml 05.

1%0 DSS:S SD01克，溶于dd2OH 001lm

6.1.% 0硫酸铵过APS（）：过硫酸提铵驱供丙烯酰动和亚胺丙烯甲胺酰合聚必所的需由自基过硫。酸100m铵g溶于d，H2dO 1ml .溶后解装，-2分0度保。存

7TEMED .（四甲基乙胺二T）MEE通过催化过D硫酸铵成自形由基而加速烯丙酰胺N和N’-,亚丙甲烯酰的胺聚合

.8 Tis-甘氨酸电r泳冲缓,液 p H.3 （ 5 8

×贮液）存：rTi sabs e5.11g 甘

氨 7酸g2

10%SD 5S0ml 或S（SD 50.g

）加dH2O至d010ml0

.96×样品冲液缓10ml0 0

5.mo/l Tris-HCL(lHp68) 7.ml06(m0olmL)/

甘油 03l(m2%)

S5SD 1g

0DT T.93g 溴

酚 1蓝2mg

ddH O 2100

至4保℃数周，或存-20保℃数月存DTT或（B者ME用前加在）

入()二操、方作：

1．将玻法板洗干璃，固净于电泳槽定；

上2．实按要验求制配不同度的浓离胶分，入T加MED后E迅速灌胶留，灌出注浓缩胶需所空间梳（子齿长再加1的cm），上用部或30水乙%醇封面或0（1%.DS(S丙烯酰浓度胺≤8)%异丁醇或丙（烯胺浓酰≥度01））% 。

．3制浓配胶缩：实验要按配制不求浓同的度离胶分一次，使性塑料管中配用制适合积体浓度的与浓缩胶加，入ETME后应D速快旋混合转，速迅入浓缩胶。灌

．灌注4浓胶：待缩离分完胶全合后（约聚03mi）,倾n出盖层液覆，dd用H2O涤洗胶凝顶数部次以，除未去合的丙聚酰烯胺，用再纸小条吸滤净留的液体残，配制好缩胶浓迅后速入灌，立并在即缩浓胶中液入插净的干梳,子再入加缩浓溶胶，以充液满梳子间的隙空梳子用用前水洗清干，净用前用临乙醇擦拭挥发，至），确干无气保泡；待胶完全聚合凝后3（m0in,）心取出梳小子清洗加，槽，样凝胶放将入泳电槽；将电泳内缓液加入冲内电脉外中槽使凝胶的上，端均能浸下泡在冲液中缓，除加排孔样内可的空能。泡

．样5处品：理将白蛋样品质与×6SS样品D理液处（25μl5+μl）在，一子个PE中混管合，01℃0加热1min0，浴冷却冰离，1心,加s；样6

加．：用微量加样样器将白蛋样质品（体总在40积μ内l，按测照蛋得的白，量算相对得加入体积数）加的样品入的底孔部，随料水平染高升升而高射注针头器。孔每样的上最蛋大白：2量040~gμ为了避。边免缘效应，未加在孔中样加等入量样品缓冲液. 的须加体等积空的1×白DSS品缓冲样液以防，相泳邻道品的样散扩。

7 ．泳电：电极插将与头适当电极相连的电，应流流阳极向；将压电调至80V跑完，浓缩胶后，将电升压高到100－201，V料的染前迁移沿至凝的胶部,底关闭源，电拔电掉极插头从电，槽中泳出取胶玻凝板，小心移动两玻璃璃间的隔板，将片插入两块其玻板的璃一角，轻撬开玻轻板璃凝胶，于其中的一贴块上于，左边一孔凝最下胶切去部一角以标凝胶的示向，方用印迹分析于则，不角。切

．8色染：考斯亮马蓝染色

考马亮蓝染斯：考液斯亮蓝马-R52 0.1 甲醇g 405lm dHdO24 0m5 冰醋酸 10lml 过滤0常温保，存；

马考斯亮蓝脱液：色甲醇 45m l醋冰 1酸ml0d Hd2 O4m5

将l凝胶于染色液中置至少5倍（体积染的液浸泡凝胶，）于摇床平放上台室温染，4色时以小，上移凝胶并回收染液，出再

将凝胶浸于脱泡色液中仍，置摇于平床台，上色4脱~8时小，间其换脱色3~液次4（脱色容器中一放小块海以绵吸洗附脱来下的染料。）四

蛋白、从质SDS聚烯丙酰凝胺转移胶固至支相持

(体一)仪器电转移装、：置CN，PVFD膜W、hamatnMM滤３、摇床等纸

（）、二电移缓冲液：转甘氨2酸9.gT rs 碱 5i.g SD8S .07g3甲醇200ml 加

ddH2O1至000m l

（三、）作操聚：（湿步：相同-转7V，02，h4V1 ）

1．dHdO清2电洗极板吸水，揩干液滴；纸

2戴手．，切套6滤纸张1与张PVF膜，与D凝胶大小致一并，标；记

3 P．DFV膜先于泡10%甲0醇ddH，O漂洗2m５i,n浸入转电移液中注，驱意滤膜除的气泡；

上．在4浅托一中盘入加少量电转移液，的把张３６M浸泡M其中；于 5．安装

移转装置

a：平．放部底极电阳（），石墨极边朝一；上

b．这一电在极放置３上张转移用浸泡液的过３MM滤，叠放纸对齐，后用然玻移璃液作滚管，挤筒出滤纸间的有气所；泡

c．P DVF膜置放滤于上，精纸确对齐并排，气泡；

出．从电d槽上撤出泳置放胶凝玻的，把凝璃胶转移一盘去离子至水中为漂略洗，后然准确放平PV于D膜上F把凝前，左下角置的膜的于标记角上排，除气；泡e

把后３．滤张纸置在放胶凝上方同样，确保层各确对齐精不，气泡。留

６．将靠上的电方极（阴）放极于层物上，平石一墨边下朝，接连源，电据凝根面胶按0.积65A/mc2m接电通，流转移１小电时左右；干转半0.是3A0电(压从4可伏到1上2伏右)

左７断开电源，．拆除转移置装去除，层，把各胶转移凝至至盛考有斯亮蓝马染的托液中盘行染色进，以检查蛋质转白是移否全完，PV将F膜浸泡D于离子水中去驱除气泡，然后，用春红Ｓ丽进染行色

五。、固定于PVD对膜上的F白质蛋进行色染

采用春红丽染色Ｓ：丽春法S红染色可法所有与疫免检学方测兼法容，这是为因该料只染短暂显色会而且在进行Wetsren印迹时可被洗。去因此丽，春红染色S不影响随并用后于测抗检的原色反显，应些这显色应反由是偶已抗联的碱性体酸酶或乳磷氧化物酶等过催化的然而，由。于其显示紫的红色容不易摄拍来，这下染色不种提供永久能性验记实录　１．10x丽春

Ｓ贮红液存：春丽红２Ｓ,g三　乙氯3酸g,0 磺水杨基30g酸加，水至001l

m　２．法：方

a. 把滤放入膜有丽春红Ｓ含使用的液盘中托色染510m~in,轻摇，

.b蛋带出现后，白室温用dd于2H漂O洗，间换期数次水；六

、闭封特异非性结位合点

将　放膜入可热加接封的料袋塑，中据根膜面，以0积.1l/mm2c的加量入闭液（5封%脱奶粉脂0，.%1Ｔeen w20P于B或SBS），尽T可排除能气泡，密，平放封摇于床平台上，温温室１育２小～时

七、。

一抗

取出膜在PBST洗涤5中imnX3；将膜次入可加热放接的塑封袋中料，加合入适度的浓抗一室，温育温小2时或3 C 71时小

、二八抗取

出膜在PBST洗涤15中mniX3次将膜放入可；热封加接的料袋塑中加入合适浓度的二，，室温抗温1育时或小73 C 05.小时

，九E、CL光检测