抗性淀粉及总淀粉测定方法

时间:2023-04-30 14:31:31 资料 我要投稿
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抗性淀粉及总淀粉测定方法

抗性淀粉及总淀粉测定方法

采用Megazyme抗性淀粉试剂盒法,测定方法见试剂盒说明书(下附) 原理(AOAC法 2002.02 ;AACC法32-40)

抗性淀粉的测定方法: 样品使用α-胰淀粉酶和淀粉葡糖苷酶(AMG)37℃振荡水浴孵育16小时,在这期间,通过两种酶的联合作用,非抗性淀粉被溶解,水解成D-葡萄糖,孵育结束后,加入等体积的乙醇或工业甲基化酒精(IMS,变性乙醇)终止反应。离心上述溶液,收集上清勿弃,底部残留絮状团即为样品中的RS,用含水的IMS或乙醇(50%v/v)洗涤絮状团,洗涤后离心,再重复一次洗涤离心,收集离心后获得的上清,与之前收集的上清混合。小心倒出试管残留的液体,将絮状团置于冰水浴中,加入2M KOH溶解,溶解的同时用磁力搅拌机剧烈搅拌。用醋酸盐缓冲液将这个溶液调至中性,用AMG将淀粉定量水解成葡萄糖。D-葡萄糖用葡糖氧化酶/过氧化物酶试剂(GOPOD)测定,这也是对样品中RS含量的测定。非抗性淀粉(可溶性淀粉)的测定可通过集中的上清液并定容至100mL,再用GOPOD测定D-葡萄糖完成。

总淀粉测定方法:即抗性淀粉与非抗性淀粉总和。

抗性淀粉检测试剂盒

K-RSTAR

(100次分析)

应用性和精确性

这个方法需要样品中RS含量多于2% w/w。如RS含量多于2% w/w,常规标准误差为±5%。少于2% w/w RS的误差更高。 试剂盒

瓶子1:淀粉葡糖苷酶AMG,12 mL,3300U/ mL,条件为pH4.5,40℃下,底物为可溶性淀粉,[单位或为200U/mL,条件为pH4.5,40℃下,底物为对硝基苯基β-麦芽糖苷]。AMG溶液应完全没有可检测到的游离D-葡萄糖。4℃下稳定性> 3年。

瓶子2:α-胰淀粉酶(胰酶,10g,3Ceralpha U/mg)。4℃下稳定性> 3年。

瓶子3:GOPOD 试剂缓冲液。磷酸钾缓冲液(1M,pH7.4),对羟基苯甲酸(0.22M)

和叠氮化钠(0.4%W/V)。4℃下稳定性> 3年。

瓶子4:GOPOD试剂酶。葡糖氧化酶(>12,000U)加上过氧化物酶(>650U)和4-氨基安替比林(80mg)。冻干粉,-20℃下稳定性>5年。

瓶子5:D-葡萄糖标准溶液(5 mL,1.0mg/mL)溶于苯甲酸0.2%(w/v)。室温下稳定性>5年。

瓶子6:抗性淀粉对照。抗性淀粉含量如表所示。室温下稳定性>5年。 溶液/悬浮液的制备

1.使用瓶子1中提供的的产品(AMG;溶液1)。这个溶液是有粘性的,因此应使用正向移液器移取分装。4℃下稳定性> 3年。

稀释AMG(300 U/ mL)。取2 mL瓶子1中的AMG浓缩液用0.1M顺丁烯二酸钠缓冲液(0.1M,pH6.0;试剂1,非提供)稀释至22mL。以5 mL为单位分装后用聚丙烯管冷冻保存。反复冻融不会影响稳定性,稳定性-20℃>5年。 用前制备

2.用100mL顺丁烯二酸钠缓冲液(100mM,pH6.0;试剂1,非提供)悬浮1g瓶子2中的产品(α-胰淀粉酶),搅拌5分钟。加入1.0mL稀释的AMG(300 U/ mL),混匀。>1500g离心10分钟,慢慢倒出上清液,这就是制备的溶液2。溶液2制备后应当天使用。

3.用蒸馏水稀释瓶子3中的产品(GOPOD 试剂缓冲液)稀释至1L,这就是制备的溶液3。制备后马上使用。 备注:

(1)如果浓缩缓冲液在-20℃下储存,它将形成结晶盐,因此必须要完全溶解才可以用蒸馏水稀释。

(2)这个缓冲液包含0.4%(w/v)的叠氮化钠。因此这是个有毒化学物,应进行相应的处理。

4.取瓶3中制备好的溶液320mL溶解瓶子4里全部的产品,定量转移这个溶液至装有剩余溶液3的瓶子中。用铝箔封盖瓶子以遮光。这就是葡萄糖测定试剂(GOPOD 试剂),可以在2-5℃保存3个月或者-20℃下保存一年。 如果试剂要以冷冻态储存,应分装后再冻存。

当试剂是新鲜制备的,它的颜色应是浅黄色或浅粉色。在4℃储存2-3个月时会演变成

深粉色。当以蒸馏水为对照时,这个溶液的吸光度应小于0.05。 5&6.使用瓶子5或6提供的产品。室温下稳定性>5年。 没有提供的试剂(应购买分析纯级)

1.顺丁烯二酸钠(马来酸钠)缓冲液(100mM,pH6.0)加上5mM二水氯化钙和叠氮化钠(0.02%w/v).

用1600mL蒸馏水溶解23.2g顺丁烯二酸,用4M(160g/L)氢氧化钠调节pH至6.0,加入0.74g二水氯化钙和0.4g叠氮化钠,并溶解。定容至2L。4℃下可保存一年。 2.醋酸钠缓冲液(1.2M,PH3.8)

将69.6mL的冰醋酸(1.05g/mL)加至800 mL的蒸馏水中,用4M氢氧化钠调节pH至pH3.8。用蒸馏水定容至1L,室温下可保存一年。

3.醋酸钠缓冲液(100mM,PH4.5)

将5.8mL的冰醋酸加至900 mL的蒸馏水中,用4M氢氧化钠调节pH至4.5。用蒸馏水定容至1L,4℃保存2个月。

4.氢氧化钾溶液(2M)

将112.2gKOH加至900 mL的去离子水中,搅拌溶解。定容至1L,密封保存。室温下可保存2年。

5.含水乙醇(或者IMS)(大约50%v/v)

将500mL乙醇(95%v/v或者99%v/v)或者工业甲基化酒精(IMS;变性乙醇;95% v/v 乙醇加上5%甲醇)至500mL的水中。密封保存,室温下稳定保存>2年。 备注:

一系列包含RS的对照样品0.6%-78%w/w可从Megazyme公司购买。 设备(推荐)

1. 离心式粉碎机,带有齿轮转子和1.0mm筛子,或类似的装置。小型样品可选择旋风磨碎机替代。

2.绞肉机-手动或电动的,装有4.5mm筛。

3.台式离心机-能够放入16×120mm玻璃试管,速度大约1500g(3000rpm)

4.振荡水浴器,可设定为每分钟100次直线运动(振荡速度为每分钟200里程),振荡距离35mm,37℃。

5.水浴锅-能够保持在50+0.1℃。 6.涡旋混匀器。 7.磁力搅拌器。 8.磁力搅拌棒-5×15mm。 9.pH计 10.计时器

11.分析天平(精确到0.1毫克)

12.分光光度计-能够设定510nm(10mm路径长度) 13.100μL移液器及一次性枪头

14.连续分配器-配有50mL管嘴,能够移取2.0mL,3.0mL和4.0mL。 15.培养管-螺旋帽,16×125mm 16.玻璃试管-16×100mm,14mL容量

17.塑料盒,可放置试管架,也可作为冰盒使用。 18.温度计-能够读取37+0.1℃和50+0.1℃。 19.容量瓶-100mL,200mL,500mL,1L,2L 样品制备

用磨碎机研磨大约50g谷物样品或冻干植物或食品,使样品粉末可过1.0mm筛。转移所有的材料至广口瓶,颠倒振荡混匀。工业淀粉一般不用研磨。用绞肉机粉碎鲜样(如罐装的豆子,香蕉,土豆),过4.5mm筛。用AOAC法925.10(15),测定干样中的含水量,根据AOAC法925.10,冻干后烘炉干燥测定鲜样中的含水量。 分析方法

(a)水解和溶液化非抗性淀粉

1.准确称取100mg(±5 mg)样品后直接倒入有螺旋帽的试管里,轻柔的拍打试管以保证样品集中在底部。

注意:对于湿样,样品大概为0.5g(准确称重),这些材料的含水量通常为60-80%。 2.每个试管中加入4.0 mLα-胰淀粉酶(10 mg/mL)其中含有AMG(3 U/mL)(溶液2) 3.盖紧试管盖子,用涡旋振荡器混匀,卧式放入振荡水浴器,与运动方向平行。 如下图所示:

4.连续振荡,37℃孵育,精确孵育时间为16小时。(备注:200里程/min)

5.把试管从水浴锅中拿出,用纸巾擦掉多余的水。拿开盖子,加入4.0mL乙醇(99% v/v)或者IMS(99% v/v),用涡旋器涡旋。

6.1500g离心,10分钟(不加盖)

7.小心倒出上清,加入2mL 50%乙醇或50% IMS重悬浮,用涡旋器涡旋,再加入6mL 50%IMS,混合,1500g离心,10分钟

8.小心倒出上清,重复上述重悬浮和离心步骤。 9.小心倒出上清,翻转试管,用纸巾吸除多余的液体。 (b)测定抗性淀粉含量

1.将试管冰浴,再向每个试管中加入磁力搅拌棒和2 mL2M的KOH,用磁力搅拌机在冰浴/水浴状态下搅拌20min,以重悬浮絮状物和溶解RS。

如下图所示:

备注:

(1)不要使用涡旋器混匀,那将会导致淀粉乳化。

(2)确保边加入KOH溶液边剧烈搅拌试管里的样品。这将会避免形成难溶的淀粉块。 2.向每个试管中加入8 mL1.2M的醋酸钠缓冲液(pH3.8),并用磁力搅拌机搅拌。立即加入0.1mLAMG(溶液1;3300U/mL),混匀,并放入50℃水浴。

3.孵育30min,期间用涡旋器间歇混匀。

4.对于RS含量>10%的样品,用水洗瓶定量转移试管里的样品至100mL容量瓶,当用洗瓶洗涤试管中的溶液时用外磁铁保持试管中的磁力棒。用蒸馏水定容至100mL,并混匀。以单位体积离心溶液,1500g,10min。

5.对于RS含量

6.将稀释的(4.)或非稀释的(5.)上清液以0.1mL为单位转移至玻璃试管(16×100mm),一式两份,加入3.0mLGOPOD试剂(溶液4),50℃孵育20分钟。

7.测量每一个溶液的在510nm下相对于空白试剂的吸光度值。 制备空白试剂

准备空白试剂:通过混匀0.1mL的100mM的醋酸钠缓冲液(pH4.5)和3.0mL的

GOPOD

试剂

制备D-葡糖糖标准品(一式四份)通过混合0.1mLD-葡萄糖(1mg/mL)和3.0mL的GOPOD试剂制备D-葡糖糖标准品。

(c)计算非抗性(可溶性的)淀粉

1.收集起始孵育[(a)7.]过程中离心获得上清液和两次50%乙醇洗涤[(a)8.和9.]获得的上清液至容量瓶中。用100mM的醋酸钠缓冲液(pH4.5)定容至100mL。混匀。

2.以0.1 mL为单位孵育溶液(一式两份)并加入10μL稀释的AMG溶液(300U/mL), 50℃孵育20分钟,加入3.0 mL GOPOD试剂(溶液4),50℃孵育20分钟。

3.计算在510nm下相对于空白试剂的吸光度值。 4.计算非抗性淀粉的含量。 计算

计算样品中抗性淀粉含量,非抗性淀粉含量和总淀粉含量(%,在干重的基础上),计算模板如下:

抗性淀粉(g/100g样品)(样品包含>10%RS)

=⊿E×F×100/0.1×1/1000×100/W×162/180 =⊿E×F/W×90

抗性淀粉(g/100g样品)(样品包含

非抗性淀粉含量(g/100g样品)

=⊿E×F×100/0.1×1/1000×100/W×162/180 =⊿E×F/W×90

总淀粉含量=抗性淀粉含量+非抗性淀粉含量 ⊿E=相对于空白试剂的吸光度值

F=从吸光度值到微克的转换(在GOPOD反应中100μgD-葡萄糖的吸光度值是确定的,F=100(D-葡萄糖的μg数)除以这100μgD-葡萄糖的GOPOD吸光度值)

100/0.1=体积校正(从100mL取0.1mL) 1/1000=从微克到毫克 W=分析样本的干重

=重量×(100-含水量)/100

100/ W=RS在样品重量中百分比因子

162/180=从测定获得的游离D-葡萄糖转换到淀粉中存在的脱水-D-葡萄糖的因子 10.3/0.1=体积校正(从10.3 mL取0.1mL),对于含有0-10%RS,当孵育溶液时没有被稀释,最终体积为-10.3 mL。当分析湿样时,体积会增大,在计算时应计算折扣。

表1.使用试管内分析方法获得的RS值与活体结果的比较

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