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广东学药学院
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C 7 5胚小胎神经鼠干胞的分离 、 培细与养定
鉴 12 万丽 1 易，林 ，桦贝 伟
剑（
1 广．药学院东中医药研 究 / 广东省院代性谢病疾中医防治药重实点室验 ，家国中医药理 局管脂高血调肝降脂症重研点究室/ 国家中 药管理医局代谢脂级实三室验 ，东 广广 5州10006 ；．2中 大学山生 科命学院干学胞研究细室 ，广 广州东510 006） 培
养神经干胞细（NSCs ） 并，对其行进鉴定方。 采法用动手法胰蛋白酶消化及 法摘： 要的 体外分目离 分离、鼠脑细胞胎，用 化的无优血清NS C 培s养基行进养培。细胞疫免光荧检法测N CSs特异 性标记子 3 d分左 获右得大未分量化巢呈悬浮状生的长 表的达结。果分 离脑的细体胞培外养48 h已 部分大壁贴 神，经干胞细团第 3 代时，。 少很见到贴细壁胞 ，几乎是神全球，经神经球 周围在存较多刺微。 细 表胞 达一中种间丝蛋白，即巢蛋 白（nes ti）n 。论结成功 分、 离鉴定 出C57小鼠 NSsC，并 在体外可件条进下行传 扩增培代养。 关键词：C 57 胎小胚；鼠 经干细胞；神 胞细培；养 蛋巢白 中分图类： 号Ｒ392 文献志标码 A：d i： 10．o396 9 j/．sin．1s060873．8214003．0．22878 （3 214）0 00354340 章文编号 ：0016
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N Ai1L， IYHual n2 ，iBEI W iejia1n 1．（uGnagdogn TMCKey L abratory ofroM taboelc iisDaees，s Ky eLbarotorayo Modfluaintg Lievrt oTrat HepeyripemlaiS ATM， anC Ldeev 3l Labraotroyo f Liid Mpteboaism SAlTM，CIn stiute oftChinese edMciinla Sicneec，GsuagnongdPha racemtucail UinvesrtyiGuan，gzohu5 1006，0hCin；a 2．St m eCle Ｒlseeacrh Depratmne，t choSlo o fifL Sceeicens， uS nYtasn Ueinersivyt， Guagnzhou， 50006，1China） bsArtatc： Obejtivc Toei slotae cu，turl aned deitnfiy hte eunarlste m cllse（ SCN ）s． Meth od NSsCs for mftal eimce ewe irsloteda bydi sesticon ad nnzeyatmi dcgiestoin a，n ductlrude ni he opttima slreufreem SCN mdeimu． he Tpesifcicb ioamker orf SNC wssa deteted by cmiumnocyotluoresfect assan．y esuＲlst hTe islatedo NSsC dahree dt oth ceutlru elpta ewihit n48 ， and hnstelik clesuetr ofsN CS weresobta iednin th eulcturesus pnseoinin abo u t 3．dOn te 3hth asspgea sf NoSC， asherend cetlsla re arelyrseen， a nd nealryal l erwene rusohperesw th spiinlu． eNsten wasi exprssee idnt ehc ulutrd ceels． ClncoulisnoN CS sar secucesfuslyl silaoted an dcutlreu dfomr fetl Ca75mi ec ，adnc olud polifrertae nivitro ． eyKwo rsd C：57 mbeyoricn mci；e nerul stea cemll；s cel cluturel；nest i
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NCSs） 具分有化 为经干细胞 神（ne uarstemlcle，l神经元 、星 形质胶细胞少和胶突质细的能胞 ，力能自 。 更我新，并足 提以供量大
脑组细胞织细的群 ， ， 胞SCsN现 发已现 多种型类的中神经系枢损统后伤 激活并被利于有组的损织伤修和功能复复恢 。因
400 收2日稿：期2 01［421
］此，
研 究NS Cs 的物学生于对神经统损系修复伤 和34［ ］。临 床用中应，退 行病变的性疗治具重有意义 要NSsC的 来源数量和限是有前存目在的主要题问。N Ss C体的培养外和增对扩实于其现在潜价值 此， ［因65 ］。SCs N的体获外取可过直接通 具有从重要用作
金项目：基广东 省育部产学教研结项目（合 202109B1011039 ） ；州广科技市计助划项目资（1 1C21307338） 3359607，2Em al： 107i515171@9qq ．c m； o通信作 要从事中主药药理究研 电，： 02话0作简介：者 万丽 198（8— ），女， 士研硕究生 ，maiE：l biwje200@ a0iyun．lco。m者 贝伟：剑（1 69—） 3，研究 ， 主员要事中从药理研究和新药研发， 药男 博，士 ，051 9：6 55 络网版出间：时2 140网出版络地址 ht：pt / ： www．/nkcine．t/ cmk / details 4/．4141．3Ｒ20．4051160．55．091．htm0l
3期第
等 ．C57
胚 胎鼠小神经干细的分离 、 培胞养鉴与 定丽，
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神
经组分织离培、养 他来其源细干的胞诱分导、 永化 主要过悬通浮长生贴和生 的 化SNCs3 种 径实途，现 壁 培 养2种 方 式进 行体 外 扩 增。 悬 浮 神经 球 （n uersphero aessya， SN A）是 N CS 体外s培养最中常 用的方，式该 基于 N法SsC 在外无体血清培养中 基可依有丝赖裂原分的系维、悬浮成球 生长、维 自持我
［7］ 更 新和分未化态的状特发点建立展来 起 。尽管神 球经法对相简易单，行 不同验室提实出各自的操
开腹腔
，露两侧暴子，宫用 科眼镊住钳宫头子端 ， 顺宫分离至子宫角子剪下处，放入有冰 PS B溶液培养皿 ，中 依次去子宫壁除和膜，胎 细仔分离得到组脑织 ， 手动得法到胎鼠脑细。胞冰 D的MM /EF12 洗 涤1遍 ，加 入0．1% （ 0 φ ）的胰蛋酶白， 在恒培温摇床 养MDEM/ F21 终消化。 用止 010上 37 ℃消化 30 min， 1 00 0 r /mni 目筛子，过滤 收，集于心离中，管离 心3 imn，去 上，清加入已 配制的 好NCS 培养基s（ 含NCsS 2 B27、 %0 2gn/ L EGF、 20m g n /m 基 L 础培 养、 基FGFb）制 成单胞悬细液 细，计数胞后， 之加 入6孔 板 。 3 1。中原 培代 养每 换天 次 1液．．22C 5 胚7 胎小 鼠NSCs 的培养 和纯 化 相差 显在镜微每下观察天鼠小 SCsN 的贴壁悬及、浮生长
作程序
但 ，NSCs 培养对件条和作技术操求要高， 不同发育较段脑组织阶的择、 细选胞分消化和接种离 代方传式 、培基成分等细节的养变都会影改 NS响C 的s培养果，结 因而如何得获稳、 体定增外能力殖和 低度成球密力强、能能 反复传代的 N够Cs 是 NSCsS研
［8 究］的基本问 题 本研究。从定特育阶发脑段织 获取细胞组 通过分，离培方养的不法优化断， 立从 建2．5 1d C57 的孕胚胎鼠脑分中离养培NSCs 方的法。
情
和况形变化。态 待细生胞密度达长 ＞ 80%到长 满 时， 贴壁对分部和浮部分分悬用别0．12 % 5的蛋胰白 消化 3 酶inm， 开分培，养至第 代 3 P3（ ，） 可以到 较纯且活得较性好的神干细经胞球。1． ．2 13．．321． 5C 胚7胎鼠的小 SNs 的鉴定 C光观察镜 倒置微镜显下察不观同间点 时神经细胞和干经神球的形态
。
11．
1
料与材方法材料
试剂
．11．
1NSCs 基培础养 （ 基山中学生大科 干院细胞 中 心张 雁教 授 惠 赠） ； B27（ Gi co 公b司 ） ； FbF （ GroSPecpaTnyT echoGenn eLt． 公d司 ）； EF （ GPrSopecTna yTehcnoeGenLtd． 公 司 ） ； 胰 蛋白 酶、
1
．2．32
N．CS s 志标 蛋 n白sten 表 达i 的 检测 将P 神3经转移至用球 L聚多氨酸包被赖盖的片玻， 养
培DME
/M 1F（2 Hylcoen公司 ）； PB S、 4% L多赖聚酸、氨 （ ）φ的 聚多甲、醛 riTonX100 t （国鼎物技术生有限公司 ）； 山羊清血 博奥森（生技物术限有公 ）司； 兔抗 巢蛋（ n白etsn） i克多抗隆（体美国 S nata ruzC公 ）司； 抗羊兔 Dy lgith94 （5 aErthx o）； Hocehs33t58、 2片液 （封Be yotime公 ）司。 1．1． 2主仪要器 高速冷冻离心机（ 德国Ep pndore ）f ； 水式 套CO2 养培（ 美箱国Shel La 公司 b） ； 荧倒光置 微镜（显 国 德eZsi s司公） 倒；相置差显镜 微 日（本O ylmusp公 司 ；）B T224S 分 天析平 ［赛 多 利 斯 Sa（troiru）s 科学仪 （器北 京） 有限 司 公］； P UEＲLAB PUＲLAEBU LTAＲG EM K 超2 Option纯7S 纯机水 、5 全0自 高 压动消 毒 水锅机 ELGA ）（； HV E H（rayiaam） ； CB499WDX冰 箱 （Haer ）i ；HT10Z3B 恒培养摇温床（上 一恒科学海仪有限器公司 ） 。．1．2 1实动物验C5 7B /L 6小鼠， 18 0，d雌 ，性 自 购中山学大实验动中心， 生物产可许证号SC KX（ 粤 201）10029 。．2 1法方 1．2． C157 胎小鼠胚 SNC 的s离 分孕将 21． 5 d的 57C 鼠断颈处孕， 用死酒精消毒后， 之腹沿正中线
［9打］
至胞大细分部贴壁 。去弃胞培细液，养用 PBS 洗 3 。遍 加4%多 聚甲醛定 固3 m0in ，加PBS 冲洗 5 mi n× 3 ；0． 2%T irtxo10 0室温 膜破1 0inm，P S 洗 B涤5 mi n 3； ×5 %的羊山血室温封清 闭03mi n P，SB 涤洗 5 mn × 3；i 一 抗 nestn i 1 （ 5∶0 ）4 ℃孵 育过 夜 、抗二 yDLiht g945A ffiniPur Goat enAtiＲabbit gIG （ +HL ）（ ∶11 00） 室 温 避 光 孵 l h， 育oeHcsh33t52 （ 18μg m/）L室温 避光复核染15 m ni，P SB冲洗 2 遍， 封片，显微镜 察观
。2
2．
1结果
57C 胚小胎鼠 SCNs 的离、分 培与纯化
养分 离
得到 的 5C 7 胚 小 鼠胎 的NSsC 镜光 下 见， 原代细可接种后，胞部分 细胞渐逐降沉贴附于6 孔板 面，表 体较小， 有光胞晕 ，悬部浮可分看到以亮很 圆的形细组成的细胞胞。团第 2以后天看可到细 胞大分贴部壁 ，悬浮细胞较亮且较， 很圆多细团块胞 。成辐 射状贴壁长 生浮部分可悬看到一以些十几个 由细组成的桑葚胞神经状球小浮生长 悬 如图 1A。 接，种 3第天 之后， 经小球直神径逐渐增大 贴，的壁胞细 块颜色逐团渐变暗原。代养中可见培神经球围周无明 显刺突 ，在明显存胞聚集细，如图 1B 。
356
广东
学院药学
报
30第卷
3
讨
论NSCs有自 我更新倾向能在体外培并养件下条
“神经球
， ”成 形可其能为枢神中系统损经伤脑缺 如血 缺、、氧 颅脑伤的神经修复外提供策略新多。年 来研者们究直一寻求用细胞进干行胞替代治细 ，疗
治． A代原 第2天 B．； 代第原3 天。 1 图原神经干细代球胞 100（ ）×Pri mry naerualst e mcles lspeherF gurie1
中疗神枢经系统神的功经能陷缺疾病， 如外伤 肿瘤 、除切术功能障碍后 、中、风 经神化退疾病性老年如痴 症呆 帕、森金、 病多发性硬化
［1等10 ］
。
4原代以材神经取球培养 NS法C 的s势优在能 于原将代胞细壁部分传代， 第贴3 天显 镜微观 察，下 见细胞可有一些贴壁，而 也有且较多神的球经悬 生浮。长经球形神较原状规代则 ，央色淡中 无明， 显沉暗 如，图 2 。 P将 1代细胞悬的部浮分代， 传第3天观 察，现 与 P象 代1类似， 是贴只细胞更少壁。P 2代细胞继传续，代第 3 观天，察可 到神经见球第 较 代2，小而数目 显增多，明 光折更强， 性且状形加更规则， 少见到贴壁细胞。神很经球周存围较在多刺微 表，传代明 后SCNs 同的性增加，质 处活跃的增于殖 状。如态 3。 较图保好持胞原细有生物的学性特 ，体与内神发经 生有好的良关性， 相又能分为化不同特的神性细胞， 经有能反效正映生理常过程干预和素因的作用， 有助 分于析 SNCs 增的殖 自、更我能力和多向新化能分 NSC 研s为究神发经育程过提了良供好的 。因力，此 型模。统传鼠大NS s 的体C培外养多采 D用EMM/ F1 2和 2N/ B 27基础 养基，培 辅一定以浓度 的bGF 和F / 或E G。F该培养在中 基SCs 必N以较高须密 度种才能接成，球 可不免地导致避了过的多经球聚 神，集影响 胞正细常生学特物的观察，性 不合 N适Ss 自C更新的研究。我 本研使用究的鼠 大SCsN 殖基 础培养增，基 是在统 DM传EM/ F21 和N2 / 2B7 基上 础改的进优化配方。 本研 表 明，究从 孕1．25 d 的 C 57 小 中 分鼠 离NSsC， 采手动法和酶用消法分化 离NSs， C及优化以
A无．第
1 代经神干胞细（ 01×0 ；）B． 第 代神经3干细胞 10（× 0 ；） C． 第 3代神 干经细胞 （200× ）。图2 代传神干细胞经Su cbltuur efo nuerlas te cmells iFgure2
血清
培基， 获养的 N得SCs 力活和产出率， 有高强较的增殖 力能， 后为神经再续的生验研实和究枢中经神系统疾 新药研病提供良好发了实的模验型基础。
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r2．2
神
经细干标志胞蛋 ne白tsi n达表检的 测3 代神经P贴壁后球， 免荧光疫学化染发色，现神
经球细 中间胞丝蛋白n stei 表n达阳性，呈胞浆着 色，同 样， 核染 料H eocsth33285将 细核着胞，色 图 如3 示所
图3
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干细胞经标志物n setni的 达表（ 040 × ，细 免胞荧 光疫）法 xprEesson of inetsi nsat h NSCs markere（ 004 ×
，cells
for hummnaadu l tadrenalme ulla dJ］ ．［ Sem tCels Tlarns lMd， e2012， 1 （1）1 783：917． ［5 ］L XiIagnqin LI， UiaTninq，gSONG K deong ，e alt．Cultu e or nefural tes melcl sn iaclium claginat ebeds［a ］ J． iBtoechnlo
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第期
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( 责编辑: 幸任建华
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0( 责
编任:辑 幸建)华
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