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离体蛙心灌流-第四组
交大医学院：离体蛙心灌流设计实验
第四组：
【实验目的】
1．学习离体蛙心灌流法。
2．观察内环境变化因素的相对恒定对维持心脏正常节律性活动的重要作用。
3．对递质、受体阻断剂的概念有初步的感性认识。
【实验原理】
1.心肌具有自动节律性收缩的特点，离体蛙心在任氏液中仍能较长时间保持其生理特性（自动节律性、兴奋性、传导性、收缩性）。
2.心收缩力和心输出量是衡量心肌生理功能的重要影响指标。采用离体蛙心灌流装置可以向任氏液中加Na+、K+、Ca2+、肾上腺素、乙酰胆碱等化学递质来学习和掌握影响心肌生理功能、心收缩力、心输出量的体液因素。
【实验动物】
蟾蜍
【实验器材和用品】
PowerLab 8S主机，桥式放大器，蛙类手术器械，玻璃蛙心插管，铁支架，张力换能器，蛙心夹，任氏液，0.65%NaCl溶 液，3%CaCl2溶液，1%KCL溶液，1:10000肾上腺素溶液，1:10000乙酰胆碱溶液，3%乳酸溶液，2.5%NaHCO3溶液。
【实验步骤】
1.暴露心脏：损毁蟾蜍脑和脊髓，将其仰卧位固定在蛙板上，用镊子提起胸骨后端腹部的皮肤，用粗剪刀剪一小口，然后由切口将剪刀伸入皮下，向左右两侧锁 骨外侧方向剪开皮肤，并向头端掀开皮肤。用镊子提起胸骨后端腹肌，在腹肌上剪一小口，将手术剪伸入胸腔内，紧贴胸壁（以免损伤下面的心脏和血管），沿皮肤 切口方向剪开肌肉，再用粗剪刀剪断左右鸟喙骨和锁骨，使创口呈一个倒三角形。用眼科镊提起心包膜，并用眼科剪将心包膜剪开，暴露出心脏。
2. 观察心脏的解剖：在腹面可以看到一个心室，其上方有两个心房。心室右上角连着一个动脉干，动脉干根部膨大称为动脉圆锥，也称主动脉球。动脉向上分成左右两 支，用玻璃分针从动脉干背面穿过，将心脏翻向头侧。在心脏背面两心房下端可看到颜色较紫红的膨大部分，为静脉窦。静脉窦是两栖类动物心脏的起搏部位，它与 下腔静脉相连。静脉窦与心房的交界处称窦房沟，而心房与心室的交界处称房室沟
3.心脏插管：用蛙心夹于心舒期夹住心尖，手提蛙心夹上连线将心脏轻轻提起，看清结构，准备插管。在主动脉下穿一棉线，打一松结，用眼科剪在左主动脉上 向心脏方向剪一小斜口，切口的深度小于管壁直径的1/2，以免插管时血管撕断。把装有任氏液的蛙心插管插入左主动脉，插至主动脉球后稍稍后退，在心室收缩 时将插管沿主动脉球后壁向心室中央方向插入，经主动脉瓣插入心室腔内。当插管内的液面随心搏上下移动时，说明插管已插入心室腔内。将预先打 好的松结扎紧，并将线固定在插管壁上的玻璃小钩上，使结扎牢固。用
滴管吸去插管中的液体，更换新鲜的任氏液。小心提起插管和心脏，剪断左右侧动脉分支和腔 静脉等（注意勿损伤静脉窦及两心房），将心脏摘出。用任氏液反复冲洗插管直至插管内任氏液完全澄清为止。
4．固定支架：把蛙心插管固定在铁支架上，蛙心夹上的连线和张力换能器相接。张力换能器头端略向下倾斜，以免药液滴入换能器内造成损坏。连线应和水平面保持垂直，松紧适当
5.仪器连接及程序设置
6.观察项目：
（1）记录正常心肌收缩曲线。适当调节channel 1 的 Range 和基线位置。得到满意的心跳搏动曲线。注意观察其中哪一部分代表心室收缩，哪一部分代表心室舒张。
（2）在任氏液中加入3%CaCl2溶液1~2滴。观察和换液同前。
（3）在任氏液中加入1%KCl溶液1~2滴，观察和换液同前。
（4）在任氏液中加入1:10000肾上腺素溶液1~2滴，观察和换液同前。
（5）在任氏液中加入1:10000乙酰胆碱溶液1~2滴，观察和换液同前。
（6）在任氏液中加入3％乳酸溶液1~2滴，观察和记录心博变化，然后加入2.5%NaHCO3溶液1~2滴，观察其恢复过程，然后换液。
（7）待各项实验步骤完成后，单击Start/Stop切换按钮停止记录。选取各实验步骤的波形，把所需的内容按先后顺序分别黏贴在时间轴的末尾。
（8）打印上述黏贴的实验结果。
【注意事项】
1. 心室插管时不可硬插，以免戳穿心壁，而应顺着主动脉走向并在心室收缩时插入。
2. 摘出心脏时，尽量多留些组织，以免损伤静脉窦。
3. 每个观察项目前后都应用任氏液进行对照记录。
4. 各种药液滴管要专用，不可混淆。每次加液的量不可过多，以刚能引起效应为度。
5. 每次加药后最好用洗净的细玻棒搅动几下，以免药液浮在上层，不易进人心脏。
6. 除最后一项外，每个观察项目时插管内液面高度保持一致。
药品清单
1.任氏液
2. 3%CaCl2溶液：无水氯化钙或2水合氯化钙（配制时注意分子量的差别）
3. 1%KCl溶液: 氯化钾
4. 1:10000肾上腺素溶液：盐酸肾上腺素
5. 1:10000乙酰胆碱溶液：氯化乙酰胆碱粉剂
6. 3％乳酸溶液: 乳酸
预期实验结果：
（1）加入2%CaCl2后，收缩的幅度变大，心率变快，甚至达到强制收缩。
（2）加入1%KCl后，收缩的幅度降低，但心率变慢。
（3）加入肾上腺素，根据所得数据，心肌的收缩变大，心率变快。
（4）加入1:10000乙酰胆碱，收缩的幅度变小，心率变慢。
（5）3%乳酸灌流H+与Ca2+竞争肌钙蛋白， Ca2+不能与肌钙蛋白结
合，心肌收缩力↓
正常时的心肌收缩曲线：
加入2%CaCl2后后的收缩曲线：
加入1%KCl后收缩曲线：
加入肾上腺素后的收缩曲线：
加入1:10000乙酰胆碱后的收缩曲线：
加入3%乳酸灌流后的收缩曲线：
实验分析
1.作为蛙心起搏点的静脉窦能按一定节律自动产生兴奋。因此，只要将离体失去神经支配的离体蛙心灌流-第四组蛙心保持在适宜的环境中，在一定时间被仍能产生节律性兴奋和收缩。另一方面，心脏正常的节律性活动有赖于内环境理化因素的相对稳定，所以，改变灌流液的成分，则可以引起心脏活动的改变。从蛙心正常心搏曲线可以看出.
2.给蛙心灌入2%CaCl2溶液后蛙心搏曲线,与图一比较发现此时心肌细胞收缩力显著增强.并且心率变快.这是因为当细胞外液钙离子浓度显著升高时胞膜内外钙离子浓度梯度增大,一方面慢反应细胞4期自动去极速度加快,心肌自律性增强,心率也就增大:另一方面工作细胞动作电位期间钙离子内流量加大导致肌浆钙离子浓度增大甚至持续增大,这样钙离子与肌钙蛋白的结合量增多甚至它们只结合不解离,最后心肌收缩力增强或者心肌持续收缩。
3.给蛙心灌入1%KCl溶液后蛙心搏曲线,与正常时比较发现此时心肌细胞收缩力降低.当细胞外液钾离子浓度轻度升高时一方面钾离子抑制钙离子内流使钙离子内流量减少,这样钙离子的兴奋偶联作用减小心肌收缩力降低.另一方面膜内外钙离子浓度梯度减小,使心肌细胞膜静息电位绝对值减小,这样静息电位与阈电位水平的电位差减小,心肌细胞兴奋性升高.当细胞外液钾离子浓度显著升高时膜内外钾离子浓度差减小,使静息电位绝对值减小至-55mV ,这样钠离子通道失活,心肌细胞兴奋性降低,心肌停搏于舒张状态。
4.给蛙心灌入肾上腺素溶液后蛙心搏曲线,可以看出心肌收缩力显著增强,心率也加快.这是因为肾上腺素主要与心肌的β1受体结合，产生正性变时、变力和变传导效应.引起强心作用。
5.给蛙心灌入1:10000乙酰胆碱溶液后蛙心搏曲线,可以看出此时心肌收缩力显
著减弱,心率明显减慢. 这是因为乙酰胆碱与心肌细胞的M2受体结合，产生负性变时、变力和变传导效应。它能提高膜对钾离子的通透性,促进钾离子外流,使静息膜电位绝对值增大,心肌兴奋性下降,心率减慢。
6.给蛙心灌入3%乳酸灌流H+与Ca2+竞争肌钙蛋白， Ca2+不能与肌钙蛋白结 合，心肌收缩力↓。
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