谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)检测试剂盒(比色法)
谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)检测试剂盒(比色法)
简介：
谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione Peroxidase，GSH-Px)是一种含硒的水溶性四聚体蛋白酶。几乎在所有组织中都有分布，在一些病理状况下谷胱甘肽过氧化物酶的活力会发生明显的变化，该酶可以清除活细胞内过氧化物，在保护细胞免受自由基损伤过程中起着关键作用。细胞内的脂类容易和自由基发生反应。
Leagene谷胱甘肽过氧化物酶检测试剂盒(Glutathione Peroxidase Assay Kit)是一种以过氧化氢为底物，通过比色法检测细胞、组织或其它样品中谷胱甘肽过氧化物酶活性的试剂盒。绝大部分细胞内的谷胱甘肽过氧化物酶都是含硒的，且硒为该酶的活性中性组成部分。细胞内也有很少量的不含硒的谷胱甘肽过氧化物酶存在。其检测原理是：GSH-Px可催化谷胱甘肽(GSH)与苯甲酸显色液发生氧化反应，使之生成黄色阴离子，通过分光光度计或酶标仪检测422nm处吸光度值测定该阴离子的浓度，间接推算GSH减少的量。本试剂盒仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。
操作步骤(仅供参考)：
1、 样本处理：
① 血清、血浆样本：从待测样本中分理出的血清或血浆不应有溶血，如果含有应去除红细
胞后，直接检测，如超过检测范围，用生理盐水稀释后检测。血清去除红细胞的简易方法如下：用抗凝管收集血液，颠倒混匀。取至少500μl全血。弃上清，用冰冷的红细胞沉淀10倍体积的'样品匀浆液重悬沉淀，再同前离心，弃上清。加入约红细胞沉淀4倍体积的冰冷的ddH2O裂解红细胞。取上清。亦可采用红细胞裂解液去除红细胞，如Leagene ACK红细胞裂解液等。
②组织样本：动物用含有20U/ml heparin的生理盐水(0.9% NaCl containing 20U/ml heparin)灌流清除血液后获取组织样品。按照每20mg组织加入200μl样品匀浆液的比例，
用玻璃匀浆器在4℃或冰浴匀浆。取上清用于酶活性的测定。
?细胞样本：对于贴壁细胞，由于后续用于酶活性的测定，避免使用胰酶消化细胞。可以使用用细胞刮或EDTA处理细胞收集细胞。细胞用无菌的PBS或生理盐水洗涤1次。按照每106细胞加入300-500μl匀浆液的比例用玻璃匀浆器在4℃或冰浴匀浆，4℃ 12000g离心10min，取上清用于酶活性的测定。
GSH工作液的配制：用GSH配制夜：GSH储存液(100μmol/L)=99:1的比例稀释至1mmol/L，即为GSH工作液(1mmol/L)，该溶液配制好以后可4℃保存1天。 2、 GSH-Px酶促反应: 可参考下表设置检测反应体系，依次加入试剂： 3、 G
SH-
Px显色反应: 可参考下表设置检测反应体系，依次加入试剂：
②混匀，置于室温孵育1min。以ddH2O调零，用分光光度计或酶标仪检测422nm处吸光度值，定义为A空白、A本底、A测定。如果用分光光度计，比色杯光径应为1cm，加入的上清量因根据比色杯的最小量程而定；如果用酶标仪，96孔板每孔应加250μl上清液。
计算：
谷胱甘肽过氧化物酶酶活力单位的定义：1个酶活力单位(1unit)是指在37℃， 每1L血清，排除非酶促反应，1min内可以催化1μmol/L GSH氧化所需(减少)的酶量为一个GSH-Px活性单位。
GSH-Px(U/L)= (A本底－A测定－A空白)/(A本底－A空白)×200
参考区间：
成年人血清GSP-Px：115±140μmol/L
注意事项：
1、 上述低温试剂避免反复冻融，以免失效或效率下降。
2、 本法中所有氧化剂或还原剂都会干扰本试剂盒的测定，如果在样品中的还原剂无法避
免，例如DTT、巯基乙醇等，则这些还原剂的总浓度至少低于0.1mM。0.15mM的DTT可以抑制40%的酶活力。
3、 常用的Triton X-100、Tween 20等去垢剂都含有较高水平的过氧化物，会影响本试剂
盒的测定。如果必须使用这些去垢剂，最好使用纯度较高并注明含较低过氧化物的去垢剂。
4、 样品可以立即测定，也可以-70℃冻存待以后测定。 5、 一定要严格控制反应时的温度，否则会引起较多误差。
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