融合酶表达载体的构建及出现问题的初探

融合酶表达载体的构建及出现问题的初探

目的:将限制性内切酶Fok Ⅰ催化区域基因(631bp)和PI-Sce Ⅰ识别区域的基凼(546bp)连接到一起,克隆入载体质粒pET28a-~+中,为表达新的限制性内切酶融合酶做准备.方法:分别以啤酒酵母和海床黄杆菌作模板,PCR扩增PI-Sce Ⅰ和FokⅠ基因片段,再将它们克隆人载体质粒pET28a~+,然后对整合质粒进行双酶切检测.结果:整合过程中,无论是PI-Sce Ⅰ还是Fok Ⅰ基因片段,都能单独成功插入载体,但当插入第二段基因片段时,酶切结果显示大约600bp的基因片段缺失了.结论:缺失可能因为两段连在一起的新基因在转化过程中对宿主细胞有毒性,宿主细胞对其进行了剪切;也可能这两段基因会形成某种高级结构而导致其不能很好的连接,产生缺失现象.

作 者： 崔宝宁 王芳 王艳萍 张治洲   作者单位： 泰达BIO-X系统生物技术研究中心,天津科技大学,天津300457  刊 名： 生物技术  PKU 英文刊名： BIOTECHNOLOGY  年，卷(期)： 2010 20(2)  分类号： Q819  关键词： 限制性内切酶   PI-Sce Fok Ⅰ   pET28a~+   克隆   双酶切   restriction endonuclease   PI - Sce Ⅰ   Fok Ⅰ   pET28a~+   clone   double digest  

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