mRNA差异显示方法研究进展

mRNA差异显示方法研究进展

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党耕町　100083 北京医科大学第三医院骨科

宋国立　美国加州大学圣地亚哥分校骨科与生物工程系

　　 哺乳动物细胞约有100?000个不同的基因，在一定时间、空间中仅有10％～15％的基因表达，这种表达受到严格调控［1］。运用mRNA 差异显示（differential display,DD）方法［2］，可将不同细胞类型或同一细胞在不同环境下表达的基因进行比较，从分子生物学水平上提供信息，这对理解细胞的生命过程极有帮助。该技术一经问世，立即得到广泛应用，但同时也遇到许多问题，所以Debouck［3］曾对该方法提出质疑。现将DD的研究进展简要综述如下。

　　一、DD方法基本原理

　　DD的基本原理是将具有可比性的细胞在某一条件下可表达的mRNA 群体通过逆转录方法变成相应的cDNA 群体，以此为模板，利用一对特殊引物，即3?anchor 引物和5?arbitrary引物，在一定条件下进行PCR扩增，得到与mRNA相对应的“标签”（tags），然后用变性聚丙烯酰胺测序胶分析其差别，将有差别的基因克隆化，进一步分析其结构与功能。DD依赖三种技术：（1）mRNA逆转录技术；（2）以特定引物进行的PCR技术；（3）DNA测序胶电泳技术。

　　二、DD方法的优点及其应用

　　用某一方法来寻找mRNA表达的差异，至少要满足下列要求：（1）在一定时间、空间里，每一个细胞约有15 000种mRNA表达，其中除少数属高丰度表达外，大量的属于低丰度表达，即要求使用的方法足以显示低丰度mRNA；（2）重复性要好；（3）实验过程中能够步步验证比较（side-by-side comparison）；（4）得到的产物能代表相应的mRNAs或cDNAs，并能由此找到相应的cDNA 序列；（5）省时，简便易行。

　　 既往对mRNA的比较研究中多用减数杂交方法［4］（subtraction hybridization），该方法灵敏，可显示低丰度RNA，但是步骤复杂，需时较长，而且在得到最终结果前无法步步验证对照比较，故不易重复，并且需要大量的RNA作起始研究材料。这一点对RNA来源不易者（如手术活检标本）极不利［5，6］。

　　DD的优点在于：（1）仅需0.2 μg总RNA作为起始材料；（2）可同时分析多组样品；（3）敏感性高，可检出低丰度mRNA；（4）实验周期短，约8天即可完成［7］，便于重复；（5）最突出的优点是实验过程中可步步验证比较。可简单地将DD的特点概括为“3SRV”，即“Simplicity，Sensitivity，Speed，Reproducibility，Versatility”。

　　DD方法因有上述优点，被广泛应用。例如：Musholt等［8］应用DD方法对手术切下的髓样甲状腺癌标本与局部转移的淋巴结进行了比较，发现了两个新的表达基因MDF-1和MDF-2，并认为这两个基因在髓样甲状腺癌的进展与转移中起了重要作用；Zuo等［9］研究溃疡

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